Genômica Analítica e Translacional

Estas são diretrizes para pesquisadores que contemplam o uso de serviços de Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) do Recurso Compartilhado ATG. Todos os pesquisadores devem consultar a equipe do ATG antes de começar a preparar ou analisar as amostras. Podemos ajudar com o projeto experimental e, se necessário, colocá-lo em contato com especialistas em bioestatística que podem ajudar no projeto experimental. É muito importante considerar o projeto experimental antes de iniciar os experimentos NGS, que podem ser bastante caros.

O RNA-seq pode ser realizado com sucesso com quantidades muito pequenas de RNA. No entanto, a quantidade necessária depende da "profundidade de leitura" necessária e se haverá contaminação por RNA ribossomal. O RNA ribossômico é 90% do RNA nas células, portanto, é necessário remover ou reduzir o RNA ribossômico antes de realizar o RNA-seq. As duas formas de fazer isso são a remoção física, por meio de "Ribodepleção", na qual sondas biotiniladas complementares aos RNAs ribossômicos são hibridizadas com as amostras de RNA, em seguida os complexos são capturados e removidos. Alternativamente, um método de preparação de biblioteca dirigido por poli-A (por exemplo, Smart-Seq) pode ser usado que evita o sequenciamento do RNA ribossômico, mas que exclui outros RNAs que não possuem caudas poliA e que podem ser de interesse (por exemplo, microRNAs). Entre em contato com a equipe de recursos compartilhados da ATG para discutir as opções antes de iniciar os experimentos.

O recurso compartilhado ATG executa análise NGS de serviço completo. No entanto, devido às complexidades da preparação da biblioteca NGS, o que ATG pode fornecer depende do tipo de experimento. Para o sequenciamento de painel direcionado e sequenciamento de exoma, precisamos apenas de amostras de DNA e iremos produzir as bibliotecas, realizar o sequenciamento e a análise inicial. Faremos um orçamento do custo previsto antes de iniciar a obra. Para RNA-seq e outras abordagens, existem muitas variações na forma como as bibliotecas podem ser construídas. Recomendamos que os usuários entrem em contato com a equipe ATG para discutir as opções antes de começar. Além do sistema Affymetrix completo, o ATG Shared Resource possui um espectrômetro Nanodrop para quantificar RNA em pequenos volumes e um Bioanalyzer Agilent para analisar rapidamente a qualidade e a quantidade de amostras de RNA ou DNA.

Os experimentos de NGS podem ser caros. O custo total para a maioria dos grandes experimentos (sequenciamento de exoma, RNA-seq, etc.) é de US $ 500 a US $ 800 por amostra, mais uma taxa de bioinformática. Alguns experimentos de sequenciamento direcionados menores custam menos por amostra. Entre em contato com a equipe para mais informações e para obter um orçamento.

Sim! Os experimentos NGS geram conjuntos de dados grandes e complexos. A análise de bioinformática não é possível sem duplicatas. Triplicados são melhores. As réplicas são realmente necessárias para obter bons resultados significativos e que valham a pena.

O ATG Shared Resource segue diretrizes rígidas de controle de qualidade e procedimentos operacionais padrão para garantir que os dados sejam da mais alta qualidade e atendam ou excedam os padrões definidos por grupos como o consórcio ENCODE. Usamos controles de pico padrão para monitorar processos internos e realizar verificações de controle de qualidade em cada estágio da produção e sequenciamento da biblioteca. Entre em contato com a equipe ATG para ver exemplos dos dados que produzimos com sucesso.

A qualidade das amostras de RNA iniciais será confirmada usando o Agilent BioAnalyzer ou usando PCR em tempo real. As bibliotecas serão verificadas de forma semelhante antes do sequenciamento. Os controles de pico são adicionados em várias etapas para monitorar o controle de qualidade interno.

Os ensaios NGS produzem conjuntos de dados grandes e complexos que contêm enormes quantidades de informações, mas também podem ser difíceis de analisar. O recurso compartilhado ATG fornece o primeiro nível de análise, incluindo análise de parâmetros de controle de qualidade, alinhamento das leituras com o genoma apropriado, identificação de variantes de sequência ou contagens de recursos, conforme apropriado, e execução de tipos diretos de interpretação, como a produção de mapas de calor para RNA-seq. No entanto, tipos mais complicados de análise de dados, como correlacionar resultados com informações do paciente, devem ser realizados com a contribuição de especialistas do Recurso Compartilhado de Bioinformática ou do Recurso Compartilhado de Bioinformática. A equipe ATG pode ajudar a estabelecer interações com os especialistas apropriados, que devem estar envolvidos desde o início para ajudar com o projeto experimental e controle de qualidade.

Existe a possibilidade de que o processo complexo envolvido na geração de dados NGS produza um "efeito dia" ou "efeito lote", no qual as amostras processadas ou analisadas no mesmo agrupamento de dados. Este é um artefato bem conhecido de análise de dados de alta dimensão e incluímos controles de pico para nos ajudar a identificar e remover esses tipos de problemas de dados.

O ATG Shared Resource tem uma equipe de especialistas em bioinformática que realizará a análise inicial dos dados e que gerenciará e fará o backup dos dados. Eles podem realizar os tipos mais simples de análises (por exemplo, expressão gênica de RNA-seq). No entanto, tipos de análises complexas ou personalizadas exigirão a entrada de especialistas adicionais dos Recursos Compartilhados de Bioinformática ou Bioinformática. A equipe ATG pode ajudar a configurar as colaborações necessárias.

A verificação é uma parte importante de cada experimento NGS, e os requisitos variam dependendo do tipo de experimento. Entre em contato com a equipe do ATG para discutir as opções de verificação dos resultados do NGS.

O diretor da instalação, Scott A. Ness, Ph.D.., pode fornecer cartas de apoio e conselhos sobre como descrever o Recurso Compartilhado ATG e os experimentos NGS em potencial em pedidos de subsídios. O Dr. Ness atuou em várias seções de estudos do NIH, ACS e DOD e revisou muitos pedidos de subsídios que incluem experimentos NGS. Suas próprias doações financiadas têm experiências NGS. Ele pode fornecer ajuda na redação de seções de sua concessão sobre experimentos NGS e pode apontar armadilhas em potencial e coisas a serem evitadas.

A maneira mais fácil de criticar um experimento NGS é descrevê-lo como uma expedição de pesca. Aqui estão algumas coisas que você definitivamente deve evitar.

1. Não se proponha a caracterizar genes que você ainda não identificou. Se você não tem dados preliminares, não sabe quais genes ou quantos genes encontrará. No entanto, eles provavelmente chegarão às centenas. Simplesmente dizer que você escolherá alguns genes interessantes para estudar é uma maneira rápida de obter uma pontuação ruim em sua bolsa. Se possível, seu experimento deve testar uma hipótese. Por exemplo, você pode fazer a hipótese de que certos genes (por exemplo, genes de apoptose) serão induzidos. Em seguida, você pode propor o uso de ensaios NGS para testar isso (e propor PCR em tempo real como uma abordagem de backup). Dessa forma, você pode testar uma hipótese, propor resultados esperados e controles (por exemplo, genes que devem subir e descer), que é uma maneira muito melhor de fazer um experimento NGS (ou qualquer outro experimento). Simplesmente ir pescar genes é uma abordagem ruim e sempre atrai a ira do comitê de revisão.
2. Simplesmente dizer que você usará algum programa de software para analisar os dados ou agrupar os genes em caminhos também o colocará em apuros. Os dados NGS podem ser extremamente complexos e requerem métodos estatísticos para análise. Os dados do caminho que são conhecidos são lamentavelmente incompletos. A maioria dos genes não está nas vias, de qualquer maneira. Você precisará de uma abordagem bem planejada para analisar os dados. Você deve ter uma maneira de dizer se o experimento funcionou ou não (por exemplo, os genes de apoptose esperados foram ativados?).
3. O experimento NGS não deve ser apenas um parágrafo no final de um de seus objetivos. Faça o que fizer, absolutamente não adicione um experimento NGS ao final de um pedido de concessão como algo que você "também fará". Os experimentos NGS são grandes, caros e complicados e não podem ser feitos em segundo plano. Muitos, muitos subsídios têm uma descrição de um parágrafo de um experimento NGS que os pesquisadores também farão. Isso é um pára-raios para as críticas dos revisores.
4. Se você está procurando genes, deve procurá-los por um motivo. Não se limite a propor a busca de genes regulados sem se propor a fazer algo com eles. Encontrar os genes que sobem e descem não é um objetivo significativo o suficiente. Você precisa estar procurando genes com algum propósito em mente (por exemplo, alguma hipótese a ser testada).